植物种子和组织的保存技术

保存种子、孢子和组织等在人工条件下使植物的种类及它们的遗传基因能得到延续，为未来 的植物利用、培育计划服务，这是植物迁地保护的另一种方法。这种方法的好处是所占的空 间小，所需的人力资源少，但资金除了一次性的投入大外，今后在维持上需要的投入也大； 虽然它能较好地保护遗传基因的多样性，但这种方法只能维持它们从自然采集时所停留的进化阶段。

一、种子的贮存

很多国家从50年代以来十分重视资源的收集和保存，已建立了国家种子保护试验站(Nationa l seed storage laboratory)，并组成了国际植物遗传局(International Board for Plant Genetic Resources)的世界性网络。

种子保存包括了野生和栽培植物的遗传基因两大部分。保存种子(对于蕨类植物来说是则是 孢子)，除了要应用上述多基因库采集法收集外，还需要一定的数量。在美国，有的规定， 在收集原始样品时，每一种起码要有一万颗种子，当然它的数量是可能困种子稀少或颗粒大 小不同而有所变化。种子保存需要为不同的种子创造不同的条件，以保证种子有高存活率。

1. 种子库的条件和种子保存的程序

根据有关资料资料，从60年代开始至1986年，全世界共建了大中型基因库225个，分布在99 个国家中，贮存了约25000 000份种质材料(Fitzgerald ,1989)仅美国国家植物种质库(Nati onal Plant Germplasm System-NPGS)就保存了8700 种植物的400 000份种子，在科罗拉多 的Fort Collins的种子库则在-196℃保存了260 000份含水量6%的植物种子(Abelson, 1991 年)。我国也已有一些科研单位建立了一批大、中、小型种质基因库，如中国农科院在1984年和1986年分两期在北京建立了一座较大型的国家农作物种质库，包括一座长期库和一座交换，而于90年代初又在青海建立了一个复份库，至1995年，已保存了30多万份材料(陈叔平，1995年)；而中科院于1996年则在西双版纳热带植物园建立了一个小型的热带濒危植物种质库。

(1)种子库的温度控制

由于种子贮藏特性的不同，也由于经济原因和贮存的对象不同，基因库设计的温度并不一致。

(2)种子保存的程序

种子库种子的保存程序主要是采集(发芽试验)、干燥、封存、储存(发芽试验)、更新长远利等，各个库对于这些程序具有不同的要求。图8和图9是美国两个种子库折操作程序参考。

2. 种子贮存的一些原理

种子是一种最主要的种质材料。贮藏种子的目的在于延长种子寿命、保护活力、保持活力并保存植物固有种质(基因)，而延长种子种子寿命是最为基本的目标。种子的寿命问题就是种子生命力控制问题，而种子的贮藏寿命与种子含水量及贮藏温度密切相关。哈灵顿认为，在一定的温度范围内(1～50℃)，温度生增加5℃，或种子含水量每增加1%，则种子贮藏寿命减半(Harrington,1972年)。1973年，罗伯茨根据对种子贮藏特性的研究，把种子分为正统型(orthodox)种子和顽拗型(recalcitrant)种子两类(Roberts, 1973年，189年)。正统型种子的种子含水量能被干燥至5%以下而不受伤害，并且其贮藏寿命随种子含水量和贮藏温度的降低而加长，大部分栽培作物的种子属于此类型。多数野生植物尤其是热带植物种子，根据目前的研究，其种子含水量必须保持某一较高水平，通常不低于15%，否则将失去生命力。罗伯茨及其研究生艾力斯通过多年研究，几经修改一，提出了一个种子贮藏寿命的计算方程式(Khan,1982年；Ellis,1988年;Robert,1989年):

式中：V-种子生命力，有概率表示，概率与百分率可以换算，因此生命力可用发芽百分率来代表；Ki-初始生命力，用概率表示，可用种子储藏开始时的发芽率换算后替代；P-储藏时间，以天为单位；M-种子含水量（通常10%以下），以湿重为基础；t-储藏温度（摄氏）；Ke、Cw、CH 及CQ是不同的物种常数，对同一个物种来说，这四个数是固定不变的。

从式中可以看出，如果贮藏时间P值一定，种子生命力与种子含水量及贮藏温度成反比关系。这些研究使人们开始进行种子的低温干燥保存，从而产生和发展了植物种质保存的基因 技术，也即是种子库或种质库(gene bank)技术。采集的种子经过良好的干燥处理，降低种子含水量(通常至10%以下)，密封于铝箔袋、铝瓶或玻璃瓶中，在黑暗的低温环境中(IBPGR 推荐长期库为-20℃，IBPGR，1985年)予以保存，每间隔一定时间进行生命力监测，这就是 基因库保存种质材料的基本过程。

3. 两种类型种子及贮存

根据种子的储藏特性，一般把种子分为两种类型，即顽拗型种子和正统型种子，而热带地区的种子较多属前者。实际上，至今对热带地区种子贮藏特性仍未有广泛研究，缺乏系统资料，而一些典型的热带植物种子的确表现出顽拗型种子特性。因而通常认为热带地区种子不能用常规基因库技术加以保存。根据干燥对种子生命力的影响，热带种子实际上也可以分为两类。

(1)顽拗型种子

这类种子不能进行干燥处理，在日常湿、温条件下干燥也会很快丧失生命力(Barton,1961年)。其种子含水量通常不能降至12%以下，否则种子将死亡。这睦种子主要发生在热带的藤黄科(Guttiffarae)、龙脑香科(Dipterocarpaceae)、漆树科(Anacardiaceae)、无患子科(Sap indaceae)、蕃荔枝科(Annonaceae.)、肉豆寇科(Myristicaceae)、桑科(Maoraceae)、胡颓子科(Elaeagnaceae)、山榄科(Sapotaceae)、马钱科(Loganiaceae)等科中。它们多数在成 熟时具有较高的含水量(表12)

顽拗型种子不适宜于干燥贮藏，通常低温贮藏条件下也很快丧失生命力。这类种了需要在潮湿的环境，如湿沙中保存，以延长寿命。低温环境对这类种子不利，尤其是零下低温(Chako , 1971年)。

亚洲热带广泛栽培的红毛丹(Nephaleum lappaceum)种子以30%的含水量保存在21～28℃左右 的潮湿环境中能维护 6 个的寿命，但当种子含水量降至20%以下时则3天内失去生命力。

芒果种子在5～8℃低温贮存20天后失去生命力，但在室温湿沙贮存3个月仍有40.0%左右的萌发率。

(2)正统型种子

这类种子可以干燥，并在低温下可以采用基因库技术进行种子保存，如禾本科植物的玉米、小麦和水稻，十字药科的胡萝卜、甜菜，葫芦科的黄瓜、南瓜，豆科的大豆、小扁豆、鹰嘴豆等。对分布于西双版纳地区、作过种子贮藏实验的124种植物种子进行了分析，说明通过低温或干燥处理，一年以后生命力仍保持50%以上的种类占59.7%(陈瑛，1987年；陈耀武 ，1986年；管康林，1982年；肖耀，1982年；钟志权，1983年)。而另外一些热带 种子出表 现出含水量减少，或贮藏温度降低有延长寿命趋势。古柯(Erythroxylum coca var.novanat ense)种子采后在常温下摊放，10天后仅40%萌发，20天后几乎完全丧失生命力，但密闭存冰箱内，30天萌发率为51.2%，50天后仍有2.6%的萌发率(陈瑛，1987年)。瓜栗(Pachira macr ocarpa)种子含水量降到14.7%于℃下2个月完全丧失生命力；当种子含水量降到3%则在保存半年后仍有50%萌发率(管康林，1982年)。对于桫椤(Alsophila spinulosa)孢子的贮存说明 了孢子含水量和贮藏的温度条件是影响其生命力保存的重要因素。据测定新鲜成熟的杪椤孢子含水量约40%，在室温条件下以塑料袋封存带孢子的叶片，孢子仅7～8天；如从新鲜叶片上快速脱下孢五，并降低孢子含水量到28.7%，装入磨口玻璃瓶在室温下贮存，孢子寿命达33天；而在冷藏条件下孢子寿命达半年以上，如干冷藏则可达463天。此外贮存空间的湿度条件下对桫椤孢子的寿命影响也较大。贮存在30%的空气湿度条件下一年后检查，孢子生命保存率为76.5%；60%的空气湿度为63.7%；70%的空气湿度为53.8%；80%的空气湿度为24% ；而900%的空气湿度则全部失去生命力(程治英等，1991年)。

一些难保存的热带种子，其失活的原因还在于采取不适当的干燥技术。种子经暴晒后对其贮藏寿命极为不利。采后经太阳暴晒干燥和于室内摊放阴干的云南萝芙(Rauvolfia yunnanens es)种子，分别贮存254天后，前者萌发率仅为7.3%，后者则保持66.0%(陈瑛，1987年)。瓦氏马钱(Strychnos wallichiana)鲜种子发芽率86.7%，阴干7天后失水44.8%(占鲜重)，发芽率50%；但晒干6小时失水35.2%，发芽率65%；晒20小时后，失水率48.9%，发芽率则已降至8 .3%(陈瑛，1987年)只要干燥方法得当，即使是一些顽拗型种子，也是不会致死的(徐是雄，1987年)。可可(The obroma cocoa) 种子在45℃下干燥即死亡，但如在20℃鼓风吹或用干燥剂吸水，使其含水量由45%迅速降到33%～35%，则在33%～35%，则在17～30℃中贮藏7天后，发芽率达67%以上(Ho r,1984年)。白木香(Santalum album)种子一般采后一周内丧失发芽力，但如在常温下加速干燥含水量降至6%，其贮藏寿命可延长10倍(张志权，1992年)。坡垒(Hopea hainaensis)咱子在33%～38%含水量、15～20℃中贮存一年以上仍保持80%的发芽率(陈青度，1982年；宋学知，1983年)。因此，热带植物种子不宜高温或日晒干燥，应在15～20℃恒温下平摊阴干或用风扇、吸水等加速干燥，这样可以扩大基轩库技在热带植物中的应用范围，使种子保存途径在热带上种 质资源保护中发挥更大的作用(殷寿华，1993年)

4. 野生亲缘种在种子库中保存情况

农业发展的历史表明，栽培作物的野生亲缘种在育种上具有巨大的经济潜力，如引自土耳其的一个小麦野生亲缘种为小麦商业变种提供的抗病基因，仅在美国一地，每年价值500万元 美元，一个埃塞俄一的大麦单株具有对大麦毁灭性的黄矮病毒病在抗性的基因，它保护了加 利福尼亚年值16000 万美元大的麦免遭此病危害；有一个野生忽布使英国啤酒有一种摽煽的苦味,使得1981年给英国啤酒赢利1500万美元(Hoyt,许定发等译，1990年)。这样，国际社会极其重视栽培作物野生亲缘种的调查、收集上新建的各种种子库除了收集、保存农作物的传统和地方品种外，野生亲缘种的收集、保存也是它们的一个重点。据Hoyt 报道(计定发等译，1990年)，世界上的种子库已对小麦、马铃薯和番茄等的野生亲级种进了广泛的收集、保存，而其他的种类也在IBPGR的推动下，正在扩大收集与保存(如表13)

我国是世界上一个重要栽培作物的起源和演化中心，具有多样化的作物野生亲缘 ，近年为已开始收集与保存。据报道(陈叔平，1995年)，在国有种子库中已收集、保存的野生亲缘种有91种，超过10种的有水稻(13种)、花生(13种)、烟草(20种)和棉花(15种)等。

二、组织离体培养技术

离体主要是以组织培养(in vitro culture)的方法保存物种，这是近年发展起来的物种迁地保护方法之一。这种方法比起上述的其他方法可以减少。而这种方法主要的问题是遗传基因 的不稳定性，尤其是当包含了愈伤组织时。当分生组织培养(meristem culture)在液态氮时 (-196℃)则有保存遗传性的潜力(Franamkel,1981年)。

热带地区植物种质保存降可采取种子基因库技术外，离体保存技术是一种重要的辅助手段。 对于具顽拗型种子的植物种类来说，它甚至是一种占主导地位的种质保存方法 。东南亚重要用材树种经龙脑香科诸物，其种子保存甚为困难，国际遗传委员会(IBPGR)在英国皇家植 物园已开始了对它们的离体保存研究。皇家植物园邱园还利用微繁殖(micropropagation)对 兰类(orchids)及蕨类(ferns)植物开展了离体保存实践(殷寿华，1993年)。

1. 慢生长的种质保存

离体保存及其研究始于70年代(罗士伟，1987年)，主要是以组织培养的方示来贮藏种质。植物细胞和培养体在适宜条件下存在着一种典型的生长模式(Reed,1989年)。首先进入称为延滞期(lag period)的慢生长阶段；随后是快生长阶段，上旨细胞以指数状态增生；最后，培养体进入生长静止期(stationary growth period)，细胞数量保持衡定。造成生长静止原因 是培养基中某种或某些关键营养耗尽，如不更换培养基，培养体会逐渐死亡。从延滞期到生长静止期的时间长度受多种因素的影响，依物种和培养体类型的不同一般为至六周。但是，通过调节和改变与培养体生长有关的某些条件，则可能延长继代培养所需时间。这就是一种称为慢生长系统(slow--growth system)的植物种质离体保存方法。

种质材料在离体保存时的生长速度可用多种方法控制，最常用的方法最降低温度。多数植物的培养体最佳生长温度为20～25℃，当降至6～12℃时生长速度明显下降。少数热带种类最 佳生长温度为30℃，一般在20℃时可降低生长速度。澳大利严国王公园与植物园(Kings Par k and Botantic Garden)将培养体保存在7～10℃，有持续弱照的环境中，继代培养时间可比通常后6～12个月(Kinsley,1984 年)。对于若干种省藤(Calamus spp.)的种质离体保存，程冶英等采用减少培养基中碳原含量、降低培养基水份含量、低盐(1/2～1/10的无机盐含量)与政党无机盐浓度的培养替使用、采用液体培养基使培养材料在低氧下生长和发取单芽在 培养基上等措施，降低了省藤细胞生长速度而使继代时间在6个月以上(程冶英,1996年)。

在培养基中加入生长延缓剂使培养体生长速度减慢也是一种常用的方法。它们或者以渗透剂 的形式如甘露聚糖醇，或者是天然激素如脱落酸。木薯尖组织培养体在20℃温度下，用4%蔗糖与0.01mg/L的苯甲氨基嘌呤(BAP)或者2%蔗糖与0.05mg/LABP，均能使其生存率在15个月的 继代培养间隔中达955。如果避免使培养基耗尽，也能长继代培养所需的时间(Henshaw,1983 )。对于桫椤的配子体世代的保存采用加大孢子播种密度(4000个/cm2)、选用高盐培养基或站加2，4-D1-4、糖浓度为0～1%，附加细胞分裂素和生长素的比为10：1，以及仅用MS培养 基的微量元素制作培养基等均可延续其生长速度，使保存材料9～16个月不继代也不会死亡( 程冶英等，1991年)。

2. 超低温的种质保存

离体保存术可以在不同地区广泛使用，但所耗经费比种子保存多。慢生长系统在种质材料的转移和保存过程中仍需要大量的人工操作，而且由同一组织培养出来的后代普遍存在着无性差异这咱差异随培养时间的增长而增加。因此，慢生长系统只能作为短期或中期贮藏种质的方法。目前正在深入研究的超低温保存法，也许能作为长期贮藏种质的离体保存方法之 一(Withers, 1986年)。这种方法是将组织体(包括种子等)保存在-19℃的液氮环境中，能 较长期的保持遗传稳定性。这一技术包括以下6个步骤：

(1)前生长

对培养体短期的生长处理，使其提高耐液氮保存的能力。如对一种茄属(Solanum sp.)植物的研究，证明必需在光照下经过2天的前生长处理，才会在液氮保存后得以生存(Towill,1981年)。

(2)防冻

培养体放入防冻液中，使其细胞降低冰点，减少因形成冰晶可能造成的损伤。防冻剂可单独或混合使用，混合使用时可以会减少防冻剂的毒害作用。分生组织或茎尖(根尖)培养体最佳 防冻剂是5%～15%的DMSO液。

(3)冷冻

降温冷冻。降温速度依不同种类有的不同。慢降温一般为1～2℃分钟，慢速降温可使本逐渐脱水，从而减少细胞间冰晶形成。但速度太慢会导致脱水过甚引起伤害，因而有时采取50～ 100℃/分钟的速度快速降温。

(4)超低温保存

将冷冻材料保存到有效低温环境中，以防止冰的游移或解体。短期或中期保存常采取-80℃到-100℃温度，长保存则采取-196℃的液氮或其蒸气(-150℃)环境。

(5)解冻

一般认为快速解冻更好。从液氮环境中取出封装好的材料，与其容器一同放入 40℃的无菌中，直到解冻后才回到室温下，未封装的材料放到20～30℃的液体培养基中解冻。

(6)生命力测定

如用TTC染色法等。中国农科院国家种质库作了荞麦花粉的液氮贮茂。采到的花粉在22～23℃温度下脱水风干30～90分钟，使含水量降至10%以下，置于密封胶管中放液氮罐内保存。解冻时采取40℃环境 经2分钟即可。经授粉试验，结实良好，取得了较好的经验。